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馬皰疹病毒1型ORF30基因原核表達載體的構建
關鍵詞：orf30基因 原核表達 載體
摘要：馬皰疹病毒1型(Equid herpesvirus 1,EHV-1)是引起孕馬流產的主要病原體之一,也與死胎、新生幼駒死亡、青年馬鼻肺炎以及一種名為馬皰疹病毒性腦脊髓病(Equine herpesvirus myeloencephalopathy,EHM)的神經系統疾病有關。近些年來,EHM出現的頻率越來越高,對養馬業和賽馬業的危害很大。最新研究結果顯示,神經致病性毒株與編碼病毒DNA聚合酶催化亞基的ORF30基因單核苷酸點突變有著很高的相關性。為了獲得馬皰疹病毒1型DNA聚合酶,并制備DNA聚合酶的多克隆抗體,本研究以EHV-1-XJ2015毒株基因組DNA為模板,擴增ORF30基因編碼區,并連接于pMD19-T載體上,用BamHI和HindIII雙酶切后,將酶切產物插入表達pET-28a(+)中,轉化入大腸桿菌DH5感受態細胞,構建ORF30基因的原核表達載體pET-28a(+)-ORF30。通過酶切、PCR擴增和測序等方法對陽性重組質粒進行了鑒定。結果表明,構建的重組質粒pET-28a(+)-ORF30經BamhⅠ和HindⅢ雙酶切后,經1%瓊脂糖凝膠電泳,電泳結果與預期相符,表明目的片段成功插入載體pET28a(+)中。通過采用特異性引物對重組質粒pET28a(+)-ORF30進行PCR鑒定,產物經1%瓊脂糖凝膠電泳觀察,得到一條大小約1074bp的清晰條帶,與目的基因大小相符,表明重組質粒pET28a(+)-ORF30構建成功。本研究為進一步探討馬皰疹病毒1型ORF30基因遺傳變異對DNA聚合酶功能的影響奠定了基礎。
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