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豬鏈球菌核酸檢測量值溯源研究及方法評估
關鍵詞：鏈球菌 豬 熒光定量pcr 量值溯源
摘要：目的針對病原微生物檢測中急需解決的計量標準和量值溯源問題，建立豬鏈球菌核酸量值熒光定量PCR方法，研制豬鏈核酸檢測標準物質，探索等效一致的核酸測量技術。方法根據已報告的DNA序列設計并合成種特異性16SrRNA引物，建立熒光定量WaR方法，摸索最佳上、下游引物配比濃度，利用已知核酸濃度的標準品作標準曲線并獲得0值與樣本起始拷貝數的關系，對方法的特異性、靈敏度、穩定性和不確定性進行評估，并進行DNA標準品效期實驗。結果建立的豬鏈球菌DNA實時定量PCR方法，最佳引物濃度為上游0．6μmoL／L，下游0．3μmol／L。方法的靈敏度為18．6DNA拷貝數，DNA最佳檢出濃度為1．86×102—1．86×104拷貝／10vL反應體系。0值只與模板的DNA起始濃度有關（F：597．60，P〈0．01），與不同的實驗時間及實驗人員（F=0．60、1．90，P〉0．05）無關。0值的不確定度為0．46％～5．40％。DNA標準品4oC可保存半年以上，而一60℃保存則可達1年以上。結論建立的熒光定量PCR方法特異性及穩定性良好，可用于豬鏈球菌核酸量值測定；制備的核酸標準物質具備國際計量標準，且穩定性好，可作為豬鏈球菌核酸檢測的量值溯源和傳遞示范的標準物質。
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