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銅綠假單胞菌溶血素共調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)純化及抗血清的制備
關(guān)鍵詞：銅綠假單胞菌 溶血素共調(diào)節(jié)蛋白 蛋白純化 抗血清
摘要：目的純化銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)溶血素共調(diào)節(jié)蛋白(Hemolysin co-regulated protein,Hcp)并制備抗血清。方法從NCBI網(wǎng)站查到銅綠假單胞菌Hcp蛋白序列,采用Signal IP 4.1預(yù)測定位及信號(hào)肽情況;登錄Swiss model網(wǎng)站預(yù)測三級(jí)結(jié)構(gòu)情況;登錄www.iedb.org網(wǎng)站預(yù)測其B細(xì)胞表位。根據(jù)Hcp基因序列設(shè)計(jì)特異性引物,以銅綠假單胞菌基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增Hcp基因,經(jīng)雙酶切后連到pET28a。將重組質(zhì)粒pET28a-Hcp轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3),然后用IPTG誘導(dǎo)重組Hcp蛋白表達(dá)。使用鎳柱親和層析法純化目的蛋白。用Hcp蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA法檢測抗血清效價(jià)。結(jié)果 Hcp定位在細(xì)菌細(xì)胞漿,無信號(hào)肽,6個(gè)單體蛋白組成一個(gè)環(huán)狀的中空結(jié)構(gòu),含有多個(gè)B細(xì)胞表位。構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒pET28a-Hcp能表達(dá)23.9×10~3大小的Hcp蛋白,鎳柱層析后得到高純度的Hcp蛋白,重組Hcp蛋白誘導(dǎo)的抗體效價(jià)大于1∶10 240。結(jié)論成功重組表達(dá)銅綠假單胞菌Hcp蛋白及高滴度的抗血清,為研究Hcp的功能奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
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