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新城疫P蛋白磷酸化位點的質譜分析和功能鑒定
關鍵詞：新城疫病毒 質譜 微型基因組 磷酸化位點
摘要：副黏病毒磷蛋白,即P蛋白(phosphoprotein),富含絲氨酸和蘇氨酸,在自然條件下磷酸化水平較高。副黏病毒P蛋白的磷酸化對病毒的轉錄和復制具有重要的作用,但新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)P蛋白磷酸化位點及其功能依然尚不明確。本研究通過LC-MS/MS質譜對NDV La Sota病毒P蛋白的磷酸化位點進行了檢測,鑒定了Ser56、Ser77、Thr78、Thr82、Ser164和Ser141六個磷酸化位點。通過在線分析,預測這些磷酸化位點的磷酸化激酶分別是PKC、CKII和GSK3。為了鑒定6個磷酸化位點的生物學功能,在已建立的表達GFP基因的NDV微型基因組質粒pTVT-LGT基礎上,用熒光素酶報告基因(luciferase)替換GFP報告基因,建立了表達熒光素酶的NDV微型基因組系統。利用“丙氨酸掃描”對6個磷酸化位點進行突變后,在NDV微型基因組平臺中進行功能鑒定。結果顯示,T78、T82和S164位磷酸化位點的缺失顯著影響了病毒RNA依賴性RNA聚合酶復合體(RNA dependent RNA polymerase,RdRp)的復制,其生物學意義有待進一步的研究。
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