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CEA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下表達(dá)Hsp70基因的重組腺病毒的構(gòu)建及鑒定
關(guān)鍵詞：重組 遺傳 熱休克蛋白質(zhì)70 cea啟動(dòng)子 腺病毒
摘要：目的構(gòu)建癌胚抗原（CEA）啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下靶向表達(dá)熱休克蛋白70（HspTO）基因的重組腺病毒。方法通過RT-PCR和PCR的方法分別擴(kuò)增人Hsp70基因和CEA啟動(dòng)子，構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pDC316-pCEA—Hsp70。將所得的穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞獲得重組腺病毒Ad5-pCEA—Hsp70。通過梯度離心純化病毒，采用半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量測(cè)定病毒滴度。分別以重組的腺病毒感染CEA陽(yáng)性的人胰腺癌BxPC3細(xì)胞和CEA陰性的SWl990細(xì)胞，通過RT-PCR和ELISA法檢測(cè)Hsp70 mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果酶切和測(cè)序證實(shí)Hsp70基因和CEA啟動(dòng)子成功插入PDC316質(zhì)粒。與骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞獲得的病毒經(jīng)PCR擴(kuò)增證實(shí)重組腺病毒構(gòu)建成功。最終獲得的病毒顆粒數(shù)達(dá)2．2×10^11vp／ml，滴度為1．5X10^10PFU／ml。重組腺病毒感染CEA陽(yáng)性表達(dá)的BxPC3細(xì)胞后，可顯著增加Hsp70 mRNA和蛋白的表達(dá)，而感染CEA陰性的SWl990細(xì)胞，Hsp70mRNA和蛋白的表達(dá)無變化。結(jié)論成功構(gòu)建了能夠在CEA陽(yáng)性細(xì)胞中靶向表達(dá)Hsp70基因的重組腺病毒Ad5-pCEAHsp70，為進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。
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